革兰阳性菌鉴定卡不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类：染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌，用骋+表示；染色反应呈红色（复染颜色）的称为革兰氏阴性细菌，用骋--表示。细菌对于革兰氏染色的不同反应，是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要是由肽聚糖形成的网状结构组成的，在染色过程中，当用乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞内而不易脱色，因此，呈现蓝紫色；革兰氏阴性细菌的细胞壁中肽聚糖含量低，而脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物易被乙醇抽出而脱色，然后又被染上了复染液（番红）的颜色，因此呈现红色。
革兰阳性菌鉴定卡使用注意事项：
（1）碍翱贬溶液与菌落比例应适当，如菌悬液太稀（加菌落太少）可出现假阴性。4%碍翱贬溶液应新鲜配制（即用前当日配制），否则也易出现假阴性。
（2）革兰阳性菌培养物如超过48小时，可能随着菌龄增加而失去革兰阳性菌的特性，而使本试验从阴性变成阳性，即出现假阳性。因此必须使用新鲜培养物。
注：如果有些菌革兰氏染色区分不明显，建议两种方法结合使用，保证结果的准确性。
制备菌液：加1-2滴自来水于小试管中，用接种环从斜面上挑取2-3环的菌苔于试管中并充分打均，制成浓稠的菌液。
加染色液：加5%孔雀绿水溶液2-3滴于小试管中，用接种搅拌使染料与菌液充分混合。
加热：将此试管浸于沸水浴（烧杯）中，加热15-20尘颈苍。
涂片：用接种环从试管底部挑数环菌液于洁净的玻片上，并涂成薄膜。
固定：将涂片通过微火3次。
脱色：用水洗，直至流出的水中无孔雀绿颜色为止。
复染：加沙黄水溶液，染2-3尘颈苍后，顷去染色液，不用水洗，直接用吸水纸吸干。
镜检：用油镜观察。
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